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组培生产的要点

文章作者:腾昊科技 发布时间:2021-09-23 11:20:01 浏览次数:177
培养基的配制
母液的配制和保存
      在植物组织培养过程中,配制培养基是日常必备工作。为减少工作量,经常使用的培养基,可先将各种药品配成浓缩一定倍数的母液,放入冰箱内保存,用时再按比例稀释,这样操作比较方便,且精确度高。母液要根据药剂的化学性质分别配制,一般配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物质等母液。
      在配制大量元素母液时,要防止在混合各种盐类时产生沉淀,为此各种药品必须在充分溶解后才能混合。在混合时要注意加入的先后顺序,把Ca2+、Mn2+、Ba2+、SO42-、PO43-错开,以免KH2PO4和MgSO4与CaCl2等发生化学反应,相互结合生成CaSO4、BaSO4、Ca3(PO4)2沉淀。另外在混合各种无机盐时,其稀释度要大,慢慢混合,同时边混合边搅拌。在配制微量元素母液时也要注意药品的添加顺序,以免产生沉淀。

      铁盐容易发生沉淀,需要单独配制。一般用FeSO4·7H2O和Na2-EDTA配成铁盐螯合剂比较稳定,不易沉淀,铁盐放在棕色瓶中保存比较稳定。
      母液要用蒸馏水配制,药品应选用纯度较高的化学纯CP或分析纯AR,以免有杂质对培养物造成不利影响。药品的称量及定容都要准确,称量不同的化学药品需使用不同的药勺,避免药品的交叉污染和混杂。每称好一种药剂应立即作一记号,以免重复或遗漏。各种药品先用少量水让其充分溶解,然后依次混合。
      配制好的母液应分别贴上标签,注明母液种类、倍数、配制时间,并在记录本上详细记载配制及称取量,以便工作的准确及日后检查。母液最好在2-4℃的冰箱中保存,特别是有机物质要求更严,储存时间不宜过长,如发现母液有霉菌污染或沉淀变质时,应重新配制。


      多数植物生长调节剂不溶于水或难溶于水,IAA、NAA、IBA、2,4-D等生长素类和GA3,可先用少量0.1molNaOH或95%酒精溶解,然后再用蒸馏水定容到所需要的体积。KT、6-BA等细胞分裂素类则可用少量1mol/L HCl加热溶解,然后加水定容。植物生长调节剂母液可以在2-4℃的冰箱中保存。配制好的植物生长调节剂母液,也应在瓶上贴上标签,注明名称、浓度、配制日期,以便配制培养基时计算,准确量取。
培养基的制取
      将配制好的各种母液按顺序排列,并逐一检查是否有沉淀或变色,避免使用已失效的母液。先取适量的蒸馏水放入容器内,然后依次用移液管按培养基配方要求量吸取预先配制好的各种母液及生长调节剂,并混合在一起。再将琼脂粉和糖加入其中,溶解混匀后加蒸馏水定容至所需体积。用0.1mol/L NaOH或HCl将培养基的pH值调至所需的数值,然后分装到培养容器中。根据材料的不同,装入培养基的量稍有差别,一般培养装入0.7~1.2cm高度,让培养材料能保持原有的状态即可,最后包扎好瓶口或盖上瓶盖;并对不同配方的培养基要做好标记,以免混淆。


      培养基的pH值是影响植物组织培养成功的因素之一。不同种类的植物,其生长发育适宜的pH值也不同,应该根据所培养的植物特性来确定pH值,多数植物要求灭菌前培养基的pH值调节到5.7~5.8。经高温高压灭菌后,培养基的pH值会下降0.2~0.8个单位,故灭菌前的pH值要高于目标pH值0.5个单位。


植物组培中材料培养的条件
      接种后的外植体应转移到培养室进行培养,培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。培养室控制的条件主要有温度、光照、湿度和气体。



温度
       温度是植物组织培养中的重要因素,在适宜的温度下植物才能良好的生长、分化。多数植物适宜生长温度是在20~30℃,低于15℃时生长停止,高于35℃会抑制正常生长和发育。一个培养室内往往培养着许多种植物,为适合大多数植物生长,培养室的温度一般设定在(25±2)℃。
       因为植物在自然界中长期进化,所以不同的植物对环境温度的要求各有差别。一般生长在高寒地区的植物,其最适生长温度较低;而生长在热带地区的植物,则对环境温度相对要求较高。如马铃薯在20℃情况下培养效果较好,菠萝在28-30℃情况下培养效果较好。在条件允许的情况下,可设立多个小培养室,根据不同植物对环境温度的要求来设定培养室温度。同时,也可根据培养室内上下层架的温差来调节,一般培养室内最上层与最下层的温差为2-3℃。



光照

      光是植物进行光合作用必不可少的条件之一,对离体培养物的生长发育具有重要的作用。光照的影响主要表现在光照强度、光照时间和光质三个方面。
(1)光照强度
      对多数植物来说,1000~4000ulx的光强即能满足其生长的需要。器官的分化需要光照,并随着试管苗的生长,光照强度需要不断地加强,才能使小苗生长健壮,并促进它从“异养”向“自养”转化,以提高移植后的成活率。通常在初代培养和继代培养阶段,1000~2500lux即可满足要求。而对于生根壮苗阶段,宜提高到3000~3500lux甚至10000lux。光照强度强,幼苗生长得粗壮,而光照强度弱,幼苗容易徒长。
       对愈伤组织的诱导来说,暗培养比光培养更合适,可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围,或置于暗室中培养。另外,在有些植物组织培养中,光的存在有时会抑制根的形成,这时可以在培养基中加入活性炭,提高根的形成率。

 
(2)光照时间
普通培养室要求每日光照12~16h。生产中,在不影响材料正常生长的条件下,尽量缩短光照时间,减少能源消耗,降低生产成本。在进行葡萄茎段培养时,对日照敏感的品种只有在短日照条件下才能形成根,而对日照长度不敏感的品种在任何条件下培养均可以形成根。
(3)光质
光质对细胞分裂和器官分化也有很大影响。如在香石竹的培养中,蓝光有利于诱导侧芽产生,还有利于蛋白质含量的增加;红光可以促进芽增长,并且生长整齐。白光有利于试管苗的生长发育,生物产量最高;红光次之;蓝光促进提高茎叶中的还原糖含量,但对总糖的影响不大;白光还能增加叶绿素的合成。在唐菖蒲的子球切块培养中,在蓝光下出苗比在白光和红光下早,且幼苗生长旺盛,根系粗壮;白光下幼苗纤细;红光下出苗量少。而红光对百合和四季豆愈伤组织的诱导和生长比在白光下好。光质对植物组织分化的影响,目前尚无一定规律可循,这可能是不同植物对光信号反应不同所致。但如果能把这些光质的作用,有意识地运用到种苗的规?;?,可达到节省能源,提高产量的目的。


湿度
组织培养中的湿度影响主要有培养容器内湿度和培养环境湿度两方面。
       容器内的湿度可保持在100%,之后随着培养时间的推移,相对湿度也会有所下降。容器内的湿度主要受琼脂含量和封口材料的影响。在冬季应适当减少琼脂用量,否则,将使培养基干硬,不利于外植物体接触或插进培养基,导致生长发育受阻。在培养容器封口材料选择上应十分注意,所选择的封口材料至少要保证在一个月内有充足水分来满足外植体的需要。如果培养容器内水分散失过多,培养基渗透压升高,会阻碍培养物的生长和分化。当然,封口材料过于密闭,影响气体交流,导致有害气体难于散去,也会影响培养物的生长和分化。
       环境湿度变化随季节和大气而有很大变动。湿度过高或过低对培养材料的生长都是不利的,过低会造成培养基失去而干枯,影响培养物的生长和分化;湿度过高会造成杂菌滋生,导致大量污染。培养室的相对湿度一般要保持在70%~80%,湿度过高时可用除湿机降湿,过低时可采用加湿机加湿、喷水或拖地来增湿。
气体环境
植物组织培养中,植物的呼吸需要氧气。在液体培养中,需进行振荡和旋转或浅层培养以解决氧气供应。在固体培养中,接种时不要把培养物全部埋入培养基中,以避免氧气不足,刚刚切割后的外植体会产生乙烯,造成材料的老化,从而影响生长和分化。另外,培养物产生二氧化碳,当浓度过高时,会阻碍培养物的生长和分化。因此要注意瓶内与外界保持通气状态,最好采用通气性好的瓶盖、有滤气膜的封口材料或棉塞。培养室要适当通风换气,改善室内的通气状况,每次通风后要进行一次消毒,避免引起培养污染。

一个完整的植物组织培养过程包括的步骤:

准备阶段
查阅相关文献,根据已成功培养的相近植物资料,结合实际制订出切实可行的培养方案。然后根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基,并经高压灭菌或过滤除菌后备用。
外植体选择与消毒
      选择合适的部位作为外植体,采回后经过适当的预处理,然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块,或剥离出茎尖,挑出花药,接种到初代培养基上。


初代培养
      接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养,促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织,或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体,最后发育形成再生植株。
继代培养
      分化形成的芽、原球茎数量有限,采用适当的继代培养基经多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后,再将一部分用于壮苗生根,另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的需提前进行病毒检测。


生根培养

       刚形成的芽苗往往比较弱小,多数无根,此时可降低细胞分裂素浓度或不添加,提高生长素浓度,促进小苗生根,提高其健壮度。


炼苗移栽

       选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗,待苗适应外部环境后,再移栽到疏松透气的基质中,注意保温、保湿、遮荫,防止病虫危害。当组培苗完全成活并生长一定大小后,即可移向大田用于生产。




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